分離純化多肽、蛋白質的常用方法
發布時間:2019-05-06閱讀量:11579來源:本站

分離方法采取何種分離純化方法要由所提取的組織材料、所要提取物質的性質決定。對蛋白質、多肽提取分離常用的方法包括:鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法等。這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化,同時上述這些方法也是蛋白、多肽類物質分析中常用的手段,如層析、叫泳等。

1.1 高效液相色譜(HPLC)

HPLC 的出現為肽類物質的分離提供了有利的方法手段,因為蛋白質、多肽的HPLC 應用與其它化合物相比,在適宜的色譜條件下不僅可以在短時間內完成分離目的,更重要的是HPLC 能在制備規模上生產具有生物活性的多肽。因此在尋找多肽類物質分離制備的最佳條件上,不少學者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何選擇固定相材料、洗脫液種類、如何分析測定都是目前研究的內容。

1.1.1 反相高效液相色譜(RP-HPLC)

結果與保留值之間的關系:利用RP-HPLC 分離多肽首先得確定不同結構的多肽在柱上的保留情況。為了獲得一系列的保留系數,Wilce 等利用多線性回歸方法對2106 種肽的保留性質與結構進行分析,得出了不同氨基酸組成對保留系數影響的關系,其中極性氨基酸殘基在2~20 氨基酸組成的肽中,可減少在柱上的保留時間;在10~60 氨基酸組成的肽中,非極性氨基酸較多也可減少在柱上的保留時間,而含5~25 個氨基酸的小肽中,非極性氨基酸增加可延長在柱上的保留時間。

同時有不少文獻報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留情況的影響,并利用計算機處理分析得到每種多肽的分離提取的最佳條件。

肽圖分析(Peptide  Mapping):肽圖分析是根據蛋白質、多肽的分子量大小以及氨基酸組成特點,使用專一性較強的蛋白水解酶[ 一般未肽鏈內切酶(endopeptidase)]作用于特殊的肽鏈位點將多肽裂解成小片斷,通過一定的分離檢測手段形成特征性指紋圖譜,肽圖分析對多肽結構研究合特性鑒別具有重要意義。

利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg 和Lys 羧基端的肽鏈的性質,通過RP-HPLC 法采用C18 柱檢測了重組人生長激素特征性胰肽圖譜。同時胰島素的肽圖經V8 酶專一裂解也制得,并可鑒別僅相差一個氨基酸殘疾的不同種屬來源的胰島素。人類腫瘤壞死因子的單克隆抗體結構也應用酶解法及在線分析技術確定了肽圖,便于鑒定分析。此項技術已經在新藥開發中得到廣泛應用。

1.1.2 疏水作用色譜(Hydrophobic interaction chromatogrphy,HIC)

HIC 是利用多肽中含有疏水基因,可與固定相之間產生疏水作用而達到分離分析的目的,其比RP-GPLC 具有較少使多肽變性的特點。利用GIC 分離生產激素(GH)產品的結構與活性比EP-GPLC 分離的要穩定,活性較穩定。Geng 等利用HIC 柱的低變性特點,將大腸桿菌表達出的經鹽酸胍乙啶變性得到人重組干擾素-γ。通過HIC 柱純化、折疊出高生物活性的產品。不同人尿表皮生長因子(EGF)也利用HIC 純化到了,均具有良好的生物活性。HIC 可將未經離子交換柱的樣品純化。而RP-HPLC 則不能達到這一要求。

1.1.3 分子排阻色譜(Sizs-Exclusion chromatogrphy,SEC)

SEC 是利用多肽分子大小、形狀差異來分離純化多肽物質,特別對一些較大的聚集態的分子更為方便,如人重組生長激素(hgH)的分離,不同結構、構型的GH 在SEC 柱上分離行為完全不同,從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體,利用SEC 研究修飾化的PEG 的分離方法,此PEC 具有半衰期長、作用強的特點。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。

1.1.4 離子交換色譜(Iron-Exchange chromatography,IEXC)

IEXC 可在中性條件下,利用多肽的帶電性不同分離純化具有生物活性的多肽。其可分為陽離子柱與陰離子柱兩大類,還有一些新型樹脂,如大孔型樹脂、均孔型樹脂、離子交換纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠樹脂等。在多肽類物質的分離分析研究中,對多肽的性質、洗脫劑、洗脫條件的研究較多,不同的多肽分離條件有所不同,特別是洗脫劑的離子強度、鹽濃度等對純化影響較大。Wu 等報道利用離子交換柱層析法,探討分離牛碳酸酐異構體和牛血清白蛋白、雞血清白蛋白酶的提取條件,獲得了有價值的數據供今后此類物質分離研究。

1.1.5 膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)

CMP+分離強蔬水性蛋白、多肽混合物的層析系統,一般有去垢劑(如SDS)溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白,并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(P-端),又具有陽離子鈣(C-端),與固定相結合主要決定于膜蛋白的大小、SDS 結合量有關。利用原子散射法研究cAMP的分離機制發現,樣品與SDS 結合后在離子交換柱上存在SDS 分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換,從而達到分級分離的目的。

1.1.6 高效置換色譜(High-Performance Displacement Chromatography,HPDC)

HPDC 是利用小分子高效置換劑來交換色譜柱上的樣品,從而達到分離的目的。它具有分離組分含量較少成分的特性。利用HPDC 鑒定分離了低于總量1% 組分的活性人重組生長激素(rHG )。在研究非毒***換劑時Jayarama 發現硫酸化葡萄糖(Detran Sulfate,DS)是對β 乳球蛋白A 和B 的良好置換劑,一般DS 的相對分子質量為1×104 和4×104 最宜。研究表明置換劑的相對分子質量越低,越易于與固定相結合,因此在分離相對分子質量小的多肽時,需要更小的置換劑才能將其置換純化出來。

1.1.7 灌注層析(Perfusion Chromatography,PC)

PC 是一種基于分子篩原理與高速流動的流動相的層析分離方法,固定相孔徑大小及流動相速度直接影響分離效果。試驗證明其在生產、制備過程中具有低投入、高產出的特性。目前市場上可供應的PC 固定相種類較多,適合于不同分子量的多肽分離使用。

1.2 親和層析(Affinity Chromatography,AC)

AC 是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親和性而分離物質的層析方法。自1968 年Cuatrecasas 提出親和層析概念以來,在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合,如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和,這些配基由天然的,也有根據其結構人工合成的。Patel 等人利用一系列親和柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。

固定金屬親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC)是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子,如Cu2+、Ni2+、Fe3+等,此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu 和His 的多肽,特別是肽序列中含有His-X-X-X-His 的結構最易結合到金屬離子親和柱上,純化效果較好。其中胰島素樣生長因子(Insylin Like Growth Factor,IGF)、二氫葉還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。

Chaiken 等人報道了另一種親和層析方法,利用反義DNA 表達產生,其與正鏈DNA 表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性,如Arg 加壓素受體復合物, 已用此法分離得到。DNA 與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上,將樣品蛋白或多肽從柱中流過,與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。

1.3 毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)--分離分析方法

CE 是在傳統的電泳技術基礎上于本世紀60 年代末由Hjerten 發明的,其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽,使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80 年代以來發展迅速,是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE 根據應用原理不同可分為以下幾種;毛細管區帶電泳Capillary Zone electrophoresis,CZE)、毛細管等電聚焦電泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)毛細管凝膠電泳(CapillaryGelElectrophoresis,CGE)和膠束電動毛細管層析(Micellar Electokinetic Electrophoresis Chromatorgraphy,MECC)等。

1.3.1 毛細管區帶電泳(Capillary Zone Electrophoresis,CZE)

CZE 分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電性決定,比傳統凝膠電泳更準確。目前存在于CZE 分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛細管硅膠柱上的硅醇發生反應,影響峰形與電泳時間,針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進,如調節電池泳液的PH 值,使與硅醇反應的極性基團減少;改進毛細管柱材料的組成,針對多肽性質的不同采取不同的CZE 方法研究分離5 個含9 個氨基酸殘基的小肽,確定了小肽分析的基本條件,即在低PH 條件下,緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2+等,此時分離速度快而且準確。

1.3.2 細管等電聚電泳(Capillary Isleletric Focusing,CIEF)

由于不同的蛋白、多肽的等電點(PI)不同,因此在具有不同pH 梯度的電泳槽中,其可在等電點pH 條件下聚集沉淀下來,而與其他肽類分離開來。CIEF 在分離、分析混合多肽物質中應用不多,主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離,如對rHG 不同異構體分離。由于在CIEF 柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。

1.3.3 毛細管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)

CGE 是基于分子篩原理,經十二烷基磺酸鈉(SDS)處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前,又有一種非交聯歡、線性、疏水多聚凝膠柱被用于多肽物質的分離分析,此電泳法適于含疏水側鏈較多的肽分離,這種凝膠易于灌注,使用壽命長,性質較為穩定。

1.3.4 膠束電動毛細管層析( Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC)

MECC 的原理是在電泳液中加入表面活性劑,如SDS,使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽,陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束,從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質,可使用權含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用,從而利用疏水作用使多肽得到分離。

1.4 多肽蛋白質分離工程的系統應用

以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合,根據分離多肽性質的不同,采用不同的分離手段。特別是后基因組時代,對于蛋白質組深入的研究,人們對于分離多肽及蛋白質的手段不斷改進,綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質,采用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法,同時利用了高效液相色譜,毛細管電泳,2-D 電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術在此研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展,大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。

分析方法

2.1 質譜分析(Mass Spectrometry, MS)

MS 在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用,特別是在分離純化后的在線分析中,MS 的高敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB)和電霧離子化質譜(Electrospray Ionization, EIS)是近幾年發展起來的新方法。

2.1.1 連續流快原子轟擊質譜(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB)

cf-FAB 是一種弱離子化技術,可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH+或(M-H)形式。主要應用于肽類的分離檢測,其具有中等分辨率,精確度大于+0.2amu,流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在測定使流動相需加0.5%-10%基質如甘油和高有機溶劑成分,使樣品在檢測探針處達到敏感化。

cf-FAB  常與HPLC、CEZ 等方法結合使用達分離分析的目的,許多多肽的cf-FAB 分析方法已經建立,并得到很好的應用。如Hideaki 等利用此法研究L-Pro、L-Ala 的四肽化合物系列。證明L-Pro 在保持小肽構相穩定性。連接分子方面具有重要意義。

2.1.2 電霧離子化質譜(Electrospray Ionozation,EIS)

EIS 可產生多價離子化的蛋白或多肽,允許相對分子質量達1×105 蛋白進行分析,分辨率在1500-2000amu。精確度在0.01%左右。EIS 更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析,且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS 與HPLC 聯合分離分析GH 和血紅蛋白均獲成功,其也可與CEZ 聯合應用。

2.1.3 基質輔助激光解析/ 離子化-飛行時間質譜(Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry,MALDI-TOF MS)

MALDI-TOF 是目前蛋白質鑒定中精確測定測定分子質量的手段,特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定,靈敏度和分辨率均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時,不但可以得到多肽的相對分子質量信息,還可以測定它的序列結構,此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用。

2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance,NMR)

NMR 因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬(由于相對分子質量太大)核信號弱等原因,在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR 的應用,分子生物學、計算機處理技術的發展,使NMR 逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。

NMR 可用于確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用于蛋白質分析中仍有許多問題需要解決,例如,如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便于定量與定性分析,如何減少數據處理的時間問題等。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少,NMR 在分析分子中含少于30 個氨基酸的小肽時是非常有用的,可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速準確分析的目的。

2.3 其他

除上述方法之外,氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV 光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用于多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。

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